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１． 定义
数字ＰＣＲ（Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ） 是一种基于单分子扩增的核酸绝对定量技术，无需依赖标准曲线，通过将反应体系分割成数万至数百万个独立微单元，实现靶基因的“有／无”二元判定，最终通过统计学方法计算目标分子拷贝数。
核心设备：数字ＰＣＲ分析仪（包括微滴生成仪、ＰＣＲ扩增仪、微滴读取仪三部分）。
２． 技术原理
工作流程
样本分割：
微滴式（ｄｄＰＣＲ）：油包水微滴（如Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ２００）。
芯片式（ｃｄＰＣＲ）：微流控芯片分舱（如Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ? ３Ｄ）。
将含有核酸模板的ＰＣＲ反应体系（含荧光探针／染料）分割至大量独立微单元（微滴或微孔）。
主流分割技术：
ＰＣＲ扩增：
微单元在传统ＰＣＲ仪中进行热循环扩增，靶分子独立扩增产生荧光信号。
荧光检测：
阳性单元：荧光信号超过阈值（含靶分子）。
阴性单元：无荧光信号（无靶分子）。
使用高通量荧光检测系统扫描每个微单元的荧光强度。
３． 核心优势
特性 说明 绝对定量 无需标准曲线，直接输出目标分子拷贝数／μＬ。 超高灵敏度 可检测低至０．００１％的罕见突变（如肿瘤ｃｔＤＮＡ）。 强抗干扰能力 对ＰＣＲ抑制剂耐受性显著高于ｑＰＣＲ。 精密度高 变异系数（ＣＶ）＜５％，适合微小差异检测（如基因表达微调）。 多重检测能力 支持多通道荧光（如ＨＥＸ／ＦＡＭ／Ｃｙ５），同时定量多个靶标。 ４． 与传统技术的对比
参数 数字ＰＣＲ（ｄＰＣＲ） 实时荧光ＰＣＲ（ｑＰＣＲ） 定量方式 绝对定量（直接计数） 相对定量（依赖Ｃｔ值／标准曲线） 灵敏度 可检测单拷贝差异 通常＞１０倍浓度差异 抗抑制能力 强（抑制剂被分散至微单元） 弱（抑制剂影响整体反应） 成本／通量 单次成本高，中低通量（１－９６样本／次） 成本低，高通量（３８４孔板） ５． 核心应用场景
（１）精准医疗
肿瘤液体活检：
超低频突变检测（如ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ）。
微小残留病灶（ＭＲＤ）监控。
无创产前诊断（ＮＩＰＴ＋）：
染色体微缺失／微重复（如ＤｉＧｅｏｒｇｅ综合征）。
（２）病原体检测
病毒超早期感染：ＨＩＶ／ＨＢＶ潜伏期低载量病毒定量。
耐药株识别：结核分枝杆菌耐药基因低频突变。
（３）基因编辑验证
ＣＲＩＳＰＲ编辑效率精确定量（如脱靶率检测）。
（４）环境与食品安全
转基因成分痕量分析（＜０．１％）。
水体／土壤中病原微生物超敏检测。
６． 技术局限性与挑战
成本高昂：微滴生成芯片／专用试剂价格较高。
通量有限：单次运行样本数通常≤９６例（远低于ｑＰＣＲ的３８４孔板）。
操作复杂度：需严格分区防污染（尤其微滴操作）。
数据解读要求高：需专业软件分析微滴聚类（如阈值设定）。
７． 仪器关键组件
模块 功能 微滴生成仪 将样本分割为均一微滴（油包水体系）或加载至微孔芯片。 ＰＣＲ扩增仪 提供标准热循环条件（与传统ＰＣＲ仪兼容）。 微滴读取仪 高通量荧光扫描仪，识别每个微滴的荧光信号（多通道滤光片系统）。 分析软件 自动识别阳／阴性微滴，计算浓度并输出结果（如ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ?、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ?）。 ８． 发展趋势
集成自动化：一体化设备整合微滴生成、扩增与检测（如Ｓｔｉｌｌａ Ｎａｉｃａ系统）。
纳升级微滴：提升分割密度（百万级／样本），进一步提高灵敏度。
多重检测升级：６色以上荧光通道，实现单次检测＞１０靶标。
成本降低：微流控芯片批量化生产推动单次检测费用下降。
临床认证加速：ＦＤＡ／ＣＥ认证试剂盒增多（如乳腺癌ＰＩＫ３ＣＡ突变检测）。
９． 代表机型
品牌 型号 技术路线 通量 Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ２００? Ａｕｔｏ ＤＧ 微滴式（ｄｄＰＣＲ） ８样本／批次 Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ? Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｑ 芯片微孔（ｃｄＰＣＲ） ２４样本／芯片 Ｓｔｉｌｌａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｎａｉｃａ? Ｓａｐｐｈｉｒｅ 微滴式（Ｃｒｙｓｔａｌ?） ６样本／芯片 Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｃｕｉｔｙ? 纳米板式 ２４／９６样本 总结
数字ＰＣＲ分析仪凭借单分子绝对定量能力，在超低丰度靶标检测领域具有不可替代性，尤其推动液体活检、痕量病原体诊断等精准医学发展。尽管存在成本与通量限制，但随着微流控技术进步和临床需求增长，其正在从科研向临床诊断快速渗透，成为分子诊断领域的“金标准”级工具。
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